企业新闻 行业动态

88bifa必发生物合作开发新型基因编辑工具,具有广阔应用前景

2018年7月10日,88bifa必发生物团队与郑州大学、河南省肿瘤医院合作在Cell Discovery上在线发表了题为“Genetic editing and interrogation with Cpf1 and caged truncated pre-tRNA-like crRNA in mammalian cells”的研究论文。88bifa必发生物与合作团队开发了一种人工设计的具有Rnase抗性的闭锁截短的pre-tRNA样crRNA (caged truncated pre-tRNA-like crRNA,catRNA) ,它可以利用Lachnospiraceae细菌种属的Cpf1(LbCpf1)进行精确高效的基因编辑。与常规crRNA相比,catRNA的特异性基因敲除和敲入分别增加了3.2倍和4.3倍。该研究揭示了catRNA的潜力和CRISPR / Cpf1系统的广泛应用前景,为哺乳动物细胞中的选择性基因扰动建立了一种简单高效的方法。

原文链接:http://www.nature.com/articles/s41421-018-0035-0

微信图片_20180809103603.jpg

研究成果

CRISPR/Cpf1是一种II类CRISPR系统,与Cas9不同,是一种由单一RNA引导的核酸内切酶,可识别富含胸苷的原型间隔区相邻序列(PAM)并在PAM位点远端产生粘性切口。 CRISPR / Cpf1系统在哺乳动物细胞、以及动物、植物和细菌中都表现出强大的基因编辑活性。有趣的是, Cpf1是一种双核酸酶,不仅可以切割靶DNA,还可以处理自身的CRISPR RNA (crRNA),而且这个过程不需要反式激活crRNA(tracrRNA)的帮助。利用这些特点,Cpf1系统最近被用于哺乳动物细胞和植物细胞中的多重基因编辑,其中Cpf1使用由多个直接重复序列组成的crRNA阵列,可同时编辑多达四个基因。

微信图片_20180809103636.jpg

图1. 具有RNA酶抗性的catRNA设计示意图

不同于Cas9的高脱靶风险,全基因组深度测序揭示了Cpf1非常精确的基因编辑特点,使得Cpf1成为Cas9的理想替代物。然而尽管Cpf1在哺乳动物细胞中可以介导有效的基因编辑,其整体效率不如Cas9。我们推测crRNA部分影响了其编辑效率,这是因为crRNA只存在一个茎环结构,比sgRNA中的多种茎环提供的RNA酶抗性要少。我们发现最稳定的RNA分子tRNA,具有多个发夹(或茎环)和3'ploy尾结构,赋予其对各种RNase酶的抗性,同时pre-tRNA偶尔在其5'末端具有甲基鸟嘌呤的帽子结构。最近在酿酒酵母中进行的一项研究发现,甲基鸟嘌呤帽子结构可保护pre-tRNA免受RNase的降解,并且帽子结构可能在成熟过程中起到保护pre-tRNA的作用。同时我们发现,截短tRNA的茎环结构可以有效破坏RNase P和RNase Z的酶切活性。

微信图片_20180809103640.jpg

图2. catRNA增强哺乳动物细胞的定点敲除和敲入

    因此,我们设计了对抗多种RNase的闭锁截短的pre-tRNA样crRNA (caged truncatedpre-tRNA-like crRNA,catRNA)。它可以利用LbCpf1进行精确高效的基因编辑,并能够将DNA核酸内切酶活性失活的LbCpf1(dCpf1)重编程为转录调节因子。我们发现,与常规crRNA相比,catRNA的特异性基因敲除和敲入分别增加了3.2倍和4.3倍。当使用电穿孔时,观察到更高的基因编辑效率的提升(高达37倍)。 我们同时还发现catRNA能够通过dCpf1激活剂进行有效的基因激活,而常规的crRNA不能进行有效的基因激活。

微信图片_20180809103642.jpg

图3. 利用catRNA和dCpf1激活子实现高效定基因激活

      综上所述,我们的研究揭示了CatRNA更高效精准得编辑的巨大前景,和CRISPR/Cpf1系统的多方面应用的可能,为哺乳动物细胞中的选择性基因扰动建立了一种简便的方法。

参考文献

1.  Zetsche, B. et al.Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell163, 759–771 (2015).

2. Kim, D. et al.Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in humancells. Nat. Biotechnol. 34, 863–868 (2016).

3. Ren, J. et al.Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1inhibition. Clin. Cancer Res. 23, 2255–2266 (2017).


研究背景

免疫细胞治疗在临床应用方面展现出巨大前景。2017年, 美国FDA批准了诺华Kymriah和Kite公司的Yescarta免疫细胞治疗CART产品,让肿瘤治愈成为现实。然而,CART产品由于每个患者均需要个性化生产,周期长,质控困难,价格昂贵。另外,部分特殊患者如婴儿和免疫功能低下者,因缺少足够健康T细胞而丧失了治疗机会,严重限制了其临床应用。因此,能够实现异体治疗的通用型CAR-T细胞治疗代表了未来的方向。

88bifa必发生物团队率先利用CRISPR/Cas9基因技术编辑健康人的T细胞,能够高效避免免疫排斥反应,制备通用型CAR-T细胞。在前期成果基础上,88bifa必发生物与其合作单位共同开发了更为高效准确的基因编辑技术,具备广阔的临床应用前景。

88bifa必发生物

88bifa必发生物是一家专注于细胞免疫疗法研发及临床转化的高科技研发创新型企业,拥有多项肿瘤细胞免疫疗法相关专利(包括三项自主研发的UCAR-T发明),其科学研发团队核心来自宾夕法尼亚大学Carl June 教授团队,参与了全球首款获批免疫治疗产品Kymriah和全美首款CRISPR基因编辑T细胞临床实验的转化研究工作。

公司拥有1000平米GMP级别临床研发转化中心,在细胞改造、扩增、质控等方面拥有数项国际领先核心技术并积累了丰富经验,并将建立一套完整、封闭、自动化符合药品生产和质量控制全球领先的GMP细胞生产体系,未来有望在肿瘤及免疫疾病治疗等领域取得突破。

     88bifa必发生物与江苏先声药业达成战略合作,完成数千万元人民币天使融资,共同推进新型免疫疗法临床开发。此外,88bifa必发生物还与多家国际国内医院和高校达成合作,充分利用各自的优势及资源,携手致力于免疫治疗技术的临床科学研究,促进中国免疫治疗行业的发展。


Copyright Nanjing Bioheng Biotech Co., Ltd.@ 2018 China All Rights Reserved